激光共聚焦顯微鏡是一種先進(jìn)的細(xì)胞和分子生物學(xué)分析儀器，已被激光，電子照相機(jī)和計算機(jī)圖像處理等現(xiàn)代高科技手段所滲透，并與傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡相結(jié)合。它以激光為光源，采用共軛聚焦原理和裝置，并使用計算機(jī)對觀察對象進(jìn)行數(shù)字圖像處理觀察，分析和輸出。它的特征是對樣品進(jìn)行斷層掃描和成像，對細(xì)胞的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行非侵入式觀察和分析。同時，使用免疫熒光標(biāo)記和離子熒光標(biāo)記探針，該技術(shù)不僅可以觀察固定的細(xì)胞和組織切片，還可以實時動態(tài)觀察和檢測活細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，分子，離子和生命活動。它越來越多地用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，已經(jīng)成為生物醫(yī)學(xué)實驗研究中重要的工具。
激光共聚焦顯微鏡也是活細(xì)胞的動態(tài)觀察、多重免疫熒光標(biāo)記和離子熒光標(biāo)記觀察的有力工具。不僅可對活的或固定的細(xì)胞及組織進(jìn)行無損傷的“光學(xué)切片”，進(jìn)行單標(biāo)記或雙標(biāo)記細(xì)胞及組織標(biāo)本的熒光定性定量分析；還可以用于活細(xì)胞生理信號，離子含量的實時動態(tài)分析監(jiān)測，粘附細(xì)胞的分選，細(xì)胞激光顯微外科和光陷阱技術(shù)等?？梢詿o損傷的觀察和分析細(xì)胞的三維空間結(jié)構(gòu)。
激光共聚焦顯微鏡的原理是用點光源照射試樣，在焦平面上形成輪廓清晰的小光斑。光斑照射后發(fā)出的熒光被物鏡收集，沿原照射光路送回由雙向色鏡組成的分光鏡。光譜儀將熒光直接發(fā)送到檢測器。光源和探測器前面有一個針孔，分別稱為照明針孔和檢測針孔。兩者的幾何尺寸相同，約100-200納米；與焦平面上的光斑相比，兩者是共軛的，即光斑可以通過一系列透鏡同時聚焦在照明針孔和檢測針孔上。這樣，來自焦平面的光可以會聚在檢測孔范圍內(nèi)，而來自焦平面上方或下方的散射光被阻擋在檢測孔之外而無法成像。激光逐點掃描樣本，檢測到針孔后的光電倍增管也逐點獲得相應(yīng)光點的共焦圖像，將其轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號傳輸至計算機(jī)。整個焦平面的清晰共焦圖像聚集在屏幕上。
每個焦平面圖像實際上是樣品的光學(xué)橫截面，這種光學(xué)截面總是具有一定的厚度，也稱為光學(xué)片。由于焦點處的光強(qiáng)遠(yuǎn)大于非焦點處的光強(qiáng)，且非焦平面光被針孔過濾，因此共焦系統(tǒng)的景深近似為零。沿z軸掃描可實現(xiàn)光學(xué)斷層掃描，并在待觀察樣品的焦斑處形成二維光學(xué)切片。將X-Y平面（焦平面）掃描與z軸（光軸）掃描相結(jié)合，將連續(xù)層次的二維圖像進(jìn)行累加，經(jīng)專用計算機(jī)軟件處理，即可得到樣品的三維圖像。即檢測針孔和光源針孔始終聚焦在同一點上，使得聚焦平面外激發(fā)的熒光無法進(jìn)入檢測針孔。
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